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TB基因分型試劑盒HV-3說明書

TB Typing Kit HV-3

TB基因分型試劑盒HV-3說明書

目錄號：K2571

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組分說明

應用                      Cat. No.          YJ2571-20       K2571-50

                           Kit Size           20             50

                           VNTR3820        400 μl         1 ml

高分辨3位點VNTR檢測    VNTR4120         400 μl         1 ml

                          VNTR3232          400 μl        1 ml

DNA 分子量標準 I          MarkerⅠ           120 μl       300μl

DNA 分子量標準 II         MarkerⅡ            100 μl      250μl

其它相關產品K2570 TB基因分型試劑盒 VNTR-9

產品簡介

    本試劑盒是以分子流行病學最新研究進展1）為基礎，經工藝優(yōu)化后形成的人型結核分枝桿菌基因分型產品。本產品利用結核分枝桿菌基因組中可變數目串聯重復序列（variable-number tandem repeats, VNTR）多態(tài)性進行基因型分型區(qū)分臨                                                床菌株，是研究結核分枝桿菌分子流行病學和監(jiān)測結核病傳播狀況的有力工具。與現有其它基于VNTR原理的結核分枝桿菌VNTR分型系統(tǒng)相比，這一分型系統(tǒng)對中國流行的菌株具有更強的分辨能力1，2，3），因此特別適合于中國用戶的需求。

    通過對各PCR反應引物序列和預混反應液成份進行精心優(yōu)化，使得本產品具有很強的抗干擾力。與用戶自配試劑相比，本產品顯著提升了特異條帶信號強度，降低了使用粗制模板（煮沸菌液）時非特異條帶的出現率，使實驗操作更加簡便、快捷的同時，提高了檢測成功率。本產品的預混反應液化學穩(wěn)定性良好，能有效抵抗反復凍融（10次）和較長時間（一周）的室溫環(huán)境，更好地適應了用戶檢測工作中的靈活性需求。

     本試劑盒是 TB 基因分型試劑盒 VNTR-9（貨號 YJ2570）的配套產品。對 VNTR-9 試劑盒鑒定為成簇或相同菌株的樣本，如有必要，可使用本產品做更精細的進一步分型鑒定。本產品中的 3 個高分辨率檢測位點 VNTR3820，VNTR4120和VNTR3232 與 VNTR-9 中的 9 個檢測位點結合使用可將檢測的分辨率指數（Hunter-Gaston index，HGI)提升至 0.993                                                                                                                1）

參考文獻

1） Luo T et al. Development of a hierarchical variable-number tandem repeat typing scheme for Mycobacterium

    tuberculosis in China. PLoS One. 2014 Feb 25;9(2)

2） Sun G et al. Discriminatory potential of a novel set of Variable Number of Tandem Repeats for genotyping

    Mycobacterium marinum. Vet Microbiol. 2011 Aug 26;152(1-2)

3） Zhang L et al. Highly polymorphic variable-number tandem repeats loci for differentiating Beijing genotype

    strains of Mycobacterium tuberculosis in Shanghai, China. FEMS Microbiol Lett. 2008 May;282(1):22-31.

注意事項

1.  本產品是 TB 基因分型試劑盒 VNTR-9（貨號 YJ2570）的配套產品。待測菌株應先經過 VNTR-9 分型檢測，再使用  本產品檢測。且本產品的檢測結果應與 VNTR-9 的檢測結果進行整合分析。

2.  為避免污染，建議制備生物時與配制 PCR Mix 在不同的地點內進行，并使用不同的移液器。

3.  在樣本 DNA 的收集，抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應注意作好標記，同時防止不同樣本間發(fā)生交叉污染。

4.  常用試劑和耗材在實驗前需高壓滅菌。

5.  每管 PCR Mix 中均含有不同的引物，不可混用?？筛鶕嶒炐枨笠淮涡苑盅b為不同的量，避免反復凍融。

6.  為避免打開反應管時，反應液飛濺，開蓋前請短暫離心，收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用 75%酒精或稀酸擦拭桌面。

7.  吸取時注意不要交叉污染 PCR Mix，建議每次取 Mix 前用 75%酒精擦拭移液器頭 2 次。

8.  實驗前準備：1×TE  緩沖液（PH=8.0）、0.5×TBE 緩沖液、瓊脂糖、溴化乙錠（EB）、普通 PCR 儀、DNA 電泳設備和凝膠成像儀、0.2 ml PCR 反應管、八聯排或 96 孔 PCR 管、不同規(guī)格的移液器：0.5-10 μl 和 20-200 μl。

操作步驟

1.  DNA 模板制備：

1.1  從固體培養(yǎng)基上刮取少量(1-2 接種環(huán))樣本，重懸于 100 ul TE 中，80°C 滅活 30 分鐘。

1.2  滅活后的菌株拿出 P3 實驗室進行如下操作：

     100°C 煮沸 10 分鐘(煮沸時注意避免 EP 管蓋子爆開，避免讓水進入管中)，立即置于冰上 2 分鐘，12,000 rpm (~13,400×g)離心 10 分鐘，取上清置于另一無菌 EP 管中，做上標記，-20°C 保存。

2 .  檢測程序：

2.1  取出 TB 基因分型試劑盒 HV-3，待液體平衡到室溫后，輕微搖晃 3-4 次混勻，然后 12,000 rpm (~13,400×g)離心5秒，使蓋上的液體回落到管內。                                                                                                    2.2  三位點 VNTR 分型：對于 12 位點結果相同的菌株需進一步進行 VNTR 分型，即增加以下 4 個位點進行比較。

1）PCR 擴增：反應體系為 20 μl。

   在每個 PCR 管里分別加入 19 μl VNTR3820、VNTR4120、VNTR3232 的  PCR Mix，加入 1 μl DNA 模板，混勻。

2）擴增條件：

a .  VNTR3820：

                        步驟           溫度              時間

                         預變性         95℃           10 min

                         變性            94℃             30 s

                        退火             58℃         30 s      30 個循環(huán)

                        延伸             72℃         90 s

                        終延伸           72℃         7 min

b.  VNTR3232、VNTR4120：

                        步驟             溫度            時間

                      預變性            95℃          10 min

                      變性              94℃            30 s

                     退火               64℃            30 s    30 個循環(huán)

                     延伸               72℃            90 s

                    終延伸             72℃            7 min

3）制膠、電泳：

   a：注意事項：  

   重要！每次實驗需要設置陽性（H37Rv 菌株 DNA）和陰性對照（去離子水）。

   關鍵！本實驗是以瓊脂糖凝膠電泳為基礎來判讀 VNTR 位點基因型，因此，為了使結果準確，在電泳這一步必須要按照統(tǒng)一的標準操作，應注意以下幾點：

   a-1：制膠所用梳子為 18 孔。

   a-2：凝膠左右邊上的兩個孔由于在電泳過程中容易使條帶變形，影響結果判讀，舍棄不用，或者在其中一個孔點上陰性對照。剩余 16 孔分為 12 個樣本，3 個 DNA Marker 和 1 個陽性對照。點樣順序分別為“1，2，M，3，4，5，

         6，  M，7，8，9，10，M，11，12，H37Rv"，數字代表樣本，M 代表 DNA Marker。

   a-3：PCR 擴增產物進行第—次電泳并使用 Marker I 時，凝膠濃度為 1%，電壓為 150V，時間為 100-120 分鐘。

   a-4：如果擴增產物片段過大（>1000bp），需要再次電泳并使用 Marker II 時，凝膠濃度為 0.8%，電壓 150V，時間為150 分鐘。

   b：制膠以及電泳過程：

   使用 1%的瓊脂糖凝膠對 PCR 擴增產物進行電泳。

   配制 1%的瓊脂糖凝膠，12×12 cm 膠盤制膠，每塊膠為 80 ml。

   b-1：稱取 0.8 g 瓊脂糖，加入 80 ml 0.5×TBE，在天平上稱重后放入微波爐，高火加熱 2-3 分鐘，使瓊脂糖*溶化，搖勻，觀察為均一透明溶液，無顆粒，再在天平稱量，補入適量的雙蒸水，以保持膠的濃度不受影響。

   b-2：待融化的凝膠冷卻至 55℃左右時加入 4 μl 溴化乙錠（10 ug/ml），輕輕旋轉以充分混勻。用 18 齒的梳子制膠，將溫熱的凝膠澆灌入 12×12 cm 膠盤。

   b-3：待凝膠*凝結（室溫下放置 40 分鐘），小心拔出梳子，取出托盤，放入電泳槽中。電泳槽中加入 0.5×TBE 緩沖液，沒過膠面 1-2 mm。

   b-4：上樣電泳：每塊膠中加入 12 個樣本（最邊上的孔不加樣），每個孔中加入 3-5 μl PCR 產物，同時每塊膠上加三個 5 μl DNA MarkerⅠ。電壓 150V，電泳時間為 100-120 分鐘。本步驟是各位點最終讀數是否準確的關鍵，需要統(tǒng)一按照此標準操作。

   b-5：部分位點在臨床菌株中存在擴增產物大于 1000 bp 的情況，對這些擴增產物再利用 0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳，同時加入 DNA Marker II 作為條帶大小對照，電壓 150V，電泳時間 150 分鐘。

4）結果顯示：

MarkerⅠ  

MarkerⅡ

5）結果分析：

   a.  如果不同菌株的 3 個高變位點基因型也相同，可確定為成簇菌株；

   b.  如果高變位點讀數高度相似，即只有 1-2 個高變位點有差別，需結合流行病學數據鑒定是否為成簇菌株；

   c.  如果 3 個高變位點基因型都不一致，鑒定為單一菌株。

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